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专业背景：计算机科学研究方向与兴趣: JavaEE-Web软件开发, 生物信息学, 数据挖掘与机器学习, 智能信息系统目前工作: 基因组, 转录组, NGS高通量数据分析, 生物数据挖掘, 植物系统发育和比较进化基因组学

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Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理

2010-01-20 22:09:23| 分类：生物学 | 标签： |举报 |字号大中小订阅

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Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理

2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。

GS FLX 测序原理

GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。

Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理 - fhqdddddd - 流浪云南

图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图

测序实验流程：

1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）；

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2、Emulsion PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；

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3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；

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4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。

Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理 - fhqdddddd - 流浪云南

技术特点：

? 速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍；

? 读长长，单个序列的读长更长，平均可达到450个碱基左右；

? 通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低；

? 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；

? 一致性好，测序结果一致性超过99.99%；

? 可以进行Pair－End测序研究；

? 简便高效，不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在一天内完成一个微生物物种的测序工作。

GS FLX系统的应用

自从2005年底GS 超高通量基因组测序系统问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液样本。目前GS系统的用户在Nature，Science，PNAS等世界顶级的期刊杂志上已经发表了五十多篇的学术论文。（详细列表请查询https://www.roche-applied-science.com/sis/sequencing/genome/index.jsp）。与GS 20系统相比较，硬件配置和软件系统方面的革新改进，使得GS FLX系统具有了广泛的应用：

全基因组测序

多达120 Mb的未知基因组的测序

－生成基因组结构概图

－研究DNA序列的组织，分布和信息

－基因筛查：寻找新基因，定位和功能

－和其他基因组进行比较研究

全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。

比较基因组研究

－识别单碱基突变

－识别突变热点和保守区域

－识别插入或者缺失的基因

－断定基因型和表型之间的相关关系（比如，研究药物抗性的遗传基础）

－基于基因测序变化进行毒性预测

－进行流行病学分析

－了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础

－进行宏基因组（metagenomics）研究

－古代化石DNA 测序研究

利用配对末端方法（Pair-End Tag）将Contigs拼接成Scaffolds。

转录组和基因调节研究

基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序列的高通量转录组分析，或者miRNA 序列的基因组范围识别，小分子和非编码RNA的测序。

研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究。

扩增产物分析

PCR产物的超精细测序（应用于医学研究的重测序）

－在混合的肿瘤样本中识别体细胞突变

－在群体水平上发现高可信度的SNP位点

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