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云之南

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Sanger双脱氧链终止法原理  

2010-01-20 22:08:16|  分类: 生物学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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      在模板指导下,聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端,使引物延长,合成出新的互补的DNA链,如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基,故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA,从而读取DNA的核苷酸序列。

 

 

双脱氧链终止法  是现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出。

  其原理是:核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

  (一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

  1.分离待测核酸模板,模板可以是DNA,也可以是RNA,可以是双链,也可以是单链。

  2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP,例如?32 PdATP和DNA聚合酶(如以RNA为模板,则用反转录酶),再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

  3.与单链模板(如以双链作模板,要作变性处理)结合的引物,在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应,32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时,由于它在3’位置没有羟基,故不与下一个dNTP结合,从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入,因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

  4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物,由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP),则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

  5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

  (二) 双脱氧测序的示剂及具体操作步骤(以双链DNA测序为例)。

  1.变性双链模板的制备

  (1) 材料 Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmo1/L EDTA,50mmo1/L 葡萄糖),1% SDS,0.2mo1/L NaOH,异丙醇,TE缓冲液pH8.0,4mol/L LiCl,冰冷 70%和无水乙醇,2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA。

  (2) 配制方法

  ① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板),离心除去上清液后,用150?l Tris/葡萄糖缓冲液 重悬菌团,在室温下放置5分钟。

  ② 加入300?l的1%SDS,0.2mol/L NaOH,颠倒混合约15次,在室温下放置15分钟,加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5),颠倒约15次混合,在冰浴中放置45分钟,然后离心5分钟。

  ③ 将650?l上清液转移至一支新管中,加入650?l异丙醇,混合后在室温下放置10分钟,离心5分钟后弃去异丙醇,抽真空干燥沉淀。

  ④ 用125?l TE(pH 8.0)重新溶解DNA,加入375?l的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分钟后,于4℃下离心5分钟。

  ⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提,加入2倍体积的异丙醇,在室温下沉淀30分钟,离心5分钟,弃去上清液。

  ⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀,离心5分钟,弃去上清液并干燥,用50?l TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

  ⑦ 取0.2?g质粒DNA,并将体积调至9?l,加入1?l 2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA,在室温下放置5分钟,加入2?l 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8?l水。

  ⑧ 加入6?l冰冷无水乙醇,混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟,在4℃下离心5分钟,小心地弃去上清液,用冰冷的70%乙醇洗沉淀,离心5分钟并小心地弃去上清液,真空抽干沉淀,并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

  2.延伸和终止反应 以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。

  (1) 材料 变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中),0.5pmol/?L寡核苷酸引物(溶解在TE中,-20℃贮存),5×测序缓冲液(200mmol/L Tris pH7.5,50mmol/L MgCl2,-20℃贮存),0.1mol/l DTT(当月新配-20℃贮存),15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP),1 000至1 500Ci/mmol ?32p dATP(在-20℃下达4至6周),修饰的T7 DNA聚合酶,标准酶稀释溶液(20mmol/L Tris-HCl pH7.5,0.5mg/mlBSA,10mmol/L ?- 巯基乙醇,4℃贮存),终止混合物(表2-30),甲酰胺上样缓冲液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0,10mg溴酚蓝,10mg二甲苯青,10ml甲酰胺)。

  表2-30 T7DNA聚合酶终止反应混合物

  反应成分 ddG ddA ddT ddC 最终浓度

  H2O 15 15 15 15 -

  5×测序缓冲液 6 6 6 6 - 1mmol/L

  4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L

  1mmol/L ddGTP 3 - - - 20μmol/L

  1mmol/L ddATP - 3 - - 20μmol/L

  1mmol/L ddTTP - - 3 - 20μmol/L

  1mmol/L ddCTP - - - 3 20μmol/L

  (2) 配制方法

  ① 取4支0.5?l小离心管,标上G、A、T、C,每管加入7?l变性的双链DNA模板(分别为1和2?g),1?l寡核苷酸引物和2?l 5×测序缓冲液混合,65℃保温2分钟,在室温下冷却30分钟。

  ② 每管加入1?l 0.1mol/L DTT,2?l 1.5mol/L 3种dNTP混合物,0.5?l ?32P dATP和2?l(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物,在室温下放置5分钟。

  ③ 按标记每管分别加入3?l 4种ddNTP终止混合物的一种。

  ④ 短促离心后,在37℃下保温5分钟。

  ⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液,上样前在80℃下加热2分钟,并迅速置于冰浴上,每个样品取3?l,上样电泳。

  3.测序反应物电泳和序列读取

  (1) 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。

  (2) 按G、A、T、C次序加入每种样品,在G、A和T各泳道上样1ml,而在C泳道上样1.5?l。

  (3) 上样完毕加压1700V电泳,根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。

  (4) 电泳完毕,在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。

  (5) 在60℃或80℃干燥30分钟后,放射自显影读取序列。

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