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云之南

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专业背景:计算机科学 研究方向与兴趣: JavaEE-Web软件开发, 生物信息学, 数据挖掘与机器学习, 智能信息系统 目前工作: 基因组, 转录组, NGS高通量数据分析, 生物数据挖掘, 植物系统发育和比较进化基因组学

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Nature Technology:新方法可对单个细胞进行测序 RNA直接测序指日可待--单分子测序技术   

2010-01-11 21:39:41|  分类: 生物信息学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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摘要: Helicos BioSciences(第三代测序仪制造商)的研究人员近日发表了一篇原理验证研究,说明利用其单分子测序技术来进行RNA直接测序的可行性,文章发表在9月23日的《Nature》在线版上。

Helicos BioSciences(第三代测序仪制造商)的研究人员近日发表了一篇原理验证(proof-of-principle,生物通注)研究,说明利用其单分子测序技术来进行RNA直接测序的可行性,文章发表在9月23日的《Nature》在线版上。

该研究小组利用一台Helicos样机,直接对酿酒酵母的RNA进行测序,而没有将其转变成cDNA。在这个过程中,他们还发现了许多酿酒酵母转录本3’端的异质性,同时有证据表明酵母中至少有一些核仁RNA和核糖体RNA是聚腺苷酸化的。

随着RNA的重要性逐渐被人所认识,研究人员也开发出多种方法来研究它。但是,许多方法仍需将RNA反转录成cDNA,而这一步会引入错误,且效率不高。研究人员写道:“人们急需一种方法,而这种方法不会有反转录、扩增、连接以及其他cDNA合成步骤的相关困难,而是能利用极少量的总RNA来综合、无偏见地浏览转录组。”

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为了让“边合成边测序”的反应适应直接的RNA测序,Milos(Helicos的首席科学家)及她的同事优化了一切,从使用的聚合酶到缓冲液再到专利的荧光核苷酸类似物。总的来说,这种方法在poly(dT)包被的表面捕获聚腺苷酸化的RNA,并利用大肠杆菌poly(A)聚合酶I来进行边合成边测序的步骤。

该小组首先对一段40个碱基的RNA序列进行测序,来检验这种方法。大约一半(48.5%)的读长是20个核苷酸或更长。最长的无误差读数是38个碱基。

随后她们将注意力转向酿酒酵母这种模式生物。因为酿酒酵母的大部分RNA本身就存在聚腺苷酸化,所以她们不需要在测序前再加上poly-A尾巴。

在这个实验中,研究小组产生了41261个读数,每个约为20个核苷酸或更长。近一半(48.4%)的读数与酵母基因组配对。90%以上的配对读数是位于已知的酵母开放读码框3’端的400个核苷酸内。

实验过程中,研究人员意外地检测到酵母RNA 3’端的异质性。她们还发现证据,暗示至少有一些酵母核糖体RNA和小核仁RNA(snoRNA)是聚腺苷酸化的。

研究人员称这种RNA直接测序方法目前的错误率约为4%,大部分是黑暗碱基(dark base)引起的缺失。插入的错误率为1-2%,而替换的概率只有0.1-0.3%。

Milos介绍说,她们还在进行相似的研究,为哺乳动物细胞的直接RNA测序开发方法。她补充道,尽管实验是在Helicos样机上完成的,但该公司正在开发Heliscope的直接RNA测序步骤。该步骤有望在明年推出。

上个月,Helicos的创始人之一Stephen Quake在两名研究人员的协助下,利用一台Heliscope测序仪和4次数据收集运行,对他本人的基因组进行了测序。详情请看:第三代单分子测序的开山之作

原文检索:

Direct RNA sequencing

Nature advance online publication 23 September 2009 | doi:10.1038/nature08390

研究人员在日前在线出版的《自然—方法学》期刊报告说,下一代的测序仪将能够读出单个细胞的全部核糖核酸分子池(RNA  pool),即转录组。

转录组提供了有关活性基因的功能、调控和互相依赖的信息。最近,科学家们将高通量测序仪应用于转录组分析(RNA-Seq),新方法让研究人员能够更为详细地了解有多少基因组被转录、每个基因产生了多少RNA变异。这种转录组分析方法的局限是它需要成百上千的细胞。  

Azim  Surani和同事将转录组分析方法应用到单个细胞的分析中,并以前所未有的精度分析了取自四细胞胚胎和卵母细胞的单个老鼠细胞的转录组。  

新方法不仅对发育生物学的研究至关重要,而且也让科学家们能够在胚胎发育的早期深入研究单个细胞中全部基因表达、研究复杂组织中的细胞异质性,并在单个细胞的水平上分析疾病的发展。

(http://www.ebiotrade.com/)

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