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云之南

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专业背景:计算机科学 研究方向与兴趣: JavaEE-Web软件开发, 生物信息学, 数据挖掘与机器学习, 智能信息系统 目前工作: 基因组, 转录组, NGS高通量数据分析, 生物数据挖掘, 植物系统发育和比较进化基因组学

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DNA甲基化学习  

2010-01-01 12:20:43|  分类: 遗传与基因组学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断,也就是人们现在比较统一的认识,即在不改变基因组序列的前提下,通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达,这种修饰以DNA甲基化最为常见。继人类基因组计划结束后,2003年人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium, HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱,即不同组织与疾病状态下,5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱,以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用。DNA甲基化的研究,逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。

 

DNA甲基化及CpG岛

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化,而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列,但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种:持续的低甲基化状态,如管家基因;去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因;高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体。

哺乳动物中,CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%,远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中,CpG序列密度很高,可以达均值的5倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,形成所谓的CpG岛[5]。通常,CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛,而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化,CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中,CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态,而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留[8]。当肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

 

DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如:缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的(Li等1992年和Okano等1999年)。此外,等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions, ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如:脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等。

 

基因组整体水平甲基化分析:

1、高效液相色谱柱(HPLC);

2、SssI 甲基转移酶法;

3、免疫化学法;

4、氯乙醛法;

 

特异性位点的DNA甲基化的检测:

1、甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction Endonuclease,MS-RE)-PCR/Southern法;

2、直接测序法(Bisulfite处理);

3、甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR);

4、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(methylation-sensitive single nucleotide primer extension,Ms-SnuPE);

5、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA);

6、甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specific single-strand conformation analysis,MS-SSCA);

7、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis,MS-DGGE);

8、甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specific melting curve analysis,MS-MCA);

9、荧光法(Methylight);

10、DNA微阵列法;

11、甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blot assay,MS-DBA);

12、甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA)

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