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云之南

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关于我

专业背景:计算机科学 研究方向与兴趣: JavaEE-Web软件开发, 生物信息学, 数据挖掘与机器学习, 智能信息系统 目前工作: 基因组, 转录组, NGS高通量数据分析, 生物数据挖掘, 植物系统发育和比较进化基因组学

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Blast使用方法攻略(二)  

2010-01-01 12:14:48|  分类: 生物信息学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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参数

仅仅运行blast的基本运行命令,得到的结果往往不能清晰准确的表示出有用的信息。最大的问题就是有太多的冗余,很多很短的比对都会出现在输出结果中,导致结果杂乱无章。例如:

                                                                    Score    E

Sequences producing significant alignments:                         (bits) Value

Contig3421   out.ace.2                                              2367   0.0 

Contig3424   out.ace.2                                               165   1e-40

Contig3423   out.ace.2                                                30   4.9 

Contig3314   out.ace.2                                                30   4.9 

……

>Contig3423   out.ace.2

          Length = 148505

Score = 30.2 bits (15), Expect = 4.9

 Identities = 15/15 (100%)

 Strand = Plus / Plus

Query: 571    aaagaataaaattat 585

              |||||||||||||||

Sbjct: 103697 aaagaataaaattat 103711

可以很明显的看出,query序列和Contig3423的比对结果不能表示两条序列的相关性。事实上这个比对结果只是一个偶然出现的重复。这样的结果不但会浪费大量的运算和存储资源,更给结果分析带来了沉重的负担。为了处理杂乱无章的比对结果,满足各种比对需求,blast设置了很多参数来限制比对的范围和输出的形式。以下多数结果以blastn举例,如不做特殊说明,这些参数适用于所有比对方式。

1.-e参数:

-e(value)参数是用来过滤比对较差的结果的,用"-e"参数指定一个实数,blast会过滤掉期望值大于这个数的比对结果。这样不但简化了结果,还缩短了运行时间和结果占用的空间。比如在上一个例子中,在命令行中加上限制期望值:

blastall -i query.fasta -d db.seq -o blast.out -p blastn -e 1e-10

那么结果中就会只剩下比对较好的结果:

                                                                   Score    E

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

Contig3421   out.ace.2                                              2367   0.0 

Contig3424   out.ace.2                                               165   1e-40

……

通常,对于不同物种间的比对,期望值设在1e-5左右即可;而对于同源性较高的物种或者同种的比对,可以适当将期望值调得更小来过滤垃圾结果。比如同一物种cDNA和染色体的比对,参数可用1e-10或更高。

2.-F参数:

-F(T/F)参数是用来屏蔽简单重复和低复杂度序列的。如果选"T",程序在比对过程中会屏蔽掉query中的简单重复和低复杂度序列;选"F"则不会屏蔽。缺省值为"T"。例如,我们将如下含有两段简单重复的序列自己和自己进行比对(重复区用小写字母表示):

>test1

TACAATAAATAAAAAAGAGCTGTCTACAGTCTTTTcgcgcgcgcgcgTTCAGAAGTAAAG

CACTATACAtttttttGTTTGTTCTTCTCAATTTAGGAAACTCAATGAACAATGAATACG

AACTATTATTACCAGTAAATACAAGTAATAC

第一次比对采用缺省参数:

blastall -i test.seq -d test.seq -o test.blast -p blastn -e 1e-5

得到的结果:

>test1

          Length = 151

Score =  186 bits (94), Expect = 1e-52

 Identities = 132/151 (87%)

 Strand = Plus / Plus

Query: 1   tacaataaataaaaaagagctgtctacagtcttttnnnnnnnnnnnnttcagaagtaaag 60

           |||||||||||||||||||||||||||||||||||            |||||||||||||

Sbjct: 1   tacaataaataaaaaagagctgtctacagtcttttcgcgcgcgcgcgttcagaagtaaag 60

Query: 61  cactatacannnnnnngtttgttcttctcaatttaggaaactcaatgaacaatgaatacg 120

           |||||||||       ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 61  cactatacatttttttgtttgttcttctcaatttaggaaactcaatgaacaatgaatacg 120

Query: 121 aactattattaccagtaaatacaagtaatac 151

           |||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 121 aactattattaccagtaaatacaagtaatac 151

……

第二次运行采用参数“-F F”:

blastall -i test.seq -d test.seq -o test.blast -p blastn -e 1e-5 -F F

得到的结果:

>test1

          Length = 151

Score =  299 bits (151), Expect = 1e-86

 Identities = 151/151 (100%)

 Strand = Plus / Plus

Query: 1   tacaataaataaaaaagagctgtctacagtcttttcgcgcgcgcgcgttcagaagtaaag 60

           ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 1   tacaataaataaaaaagagctgtctacagtcttttcgcgcgcgcgcgttcagaagtaaag 60

Query: 61  cactatacatttttttgtttgttcttctcaatttaggaaactcaatgaacaatgaatacg 120

           ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 61  cactatacatttttttgtttgttcttctcaatttaggaaactcaatgaacaatgaatacg 120

Query: 121 aactattattaccagtaaatacaagtaatac 151

           |||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 121 aactattattaccagtaaatacaagtaatac 151

比较两个结果,我们看出使用缺省参数的比对结果损失了一部分信息,得到的统计结果也出现失真,期望值和identity都没有反映出真实情况。有时较长的重复序列甚至会导致比对终止。加了"-F F"就保证了比对结果的完整性。通常在大规模、低精度的比对中,往往用缺省参数,这样能避免程序把过多的时间浪费在无意义的简单重复上,提高运行速度;而在小规模、高精度的比对中,需要加上参数"-F F",保证比对的精确度和完整性。

3.-m参数:

“-e”参数能够做到筛选适当的比对结果,但是即使如此,blast的输出结果仍然非常庞大并且难以处理。为了精简输出、节省存储空间、实现更多功能并使结果易于处理,blast提供了参数“-m (integer)”来设定输出格式,可供选择的值为0~11之间的整数,缺省为0。下面就通过实例逐个解析“-m”参数能够实现的输出功能。

输入文件的内容(针对-m 0到-m 7),其中:加粗的区域是三条序列的重合位置,注意subject1多一个碱基。

query.fasta:

>query1

TACAATAAATAAAATAGAGCTGTCTACAGTACTTTTTCAGGAACTCCTTCAGAAGTAAAG

CACTATACAtttttttGTTTGTTCTTTTCAATTTAGGAAACTCAATGAACAATGAATACG

AACTATTATTACCAGTAAATACAAGTAATAC

database.fasta:

>subject1

TCCTTCAGAAGTAAAGCACTATACAtttttttGTTTGTTCTTTTCAATTTAGGAAACTCA

AATGAACAATGAATAC

>subject2

AATTTAGGAAACTCAATGAACAATGAATACGAACTATTATTACCAGTAAATACAAGTAAT

输出:

-m 0:缺省参数,显示一个query和一个subject两两比对的信息。

>subject1

          Length = 76

Score = 93.7 bits (47), Expect = 1e-24

 Identities = 68/76 (89%), Gaps = 1/76 (1%)

 Strand = Plus / Plus

Query: 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactc- 103

           |||||||||||||||||||||||||        ||||||||||||||||||||||||||

Sbjct: 1   tccttcagaagtaaagcactatacatttttttgtttgttcttttcaatttaggaaactca 60

……

-m 1:显示query在所有subjects上的定位信息,并显示一致性比对信息,subject之间不同的碱基会被标出。

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

subject2                                                             119   2e-32

subject1                                                              94   1e-24

QUERY 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactca 104

                                                  ............... 15

     .........................ttttttt............................ 61

                                                                     \

                                                                     |

                                                                     a

……

-m 2:显示query在所有subjects上的定位信息但是不显示一致性比对信息,subject之间不同的碱基会被标出。

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

subject2                                                             119   2e-32

subject1                                                              94   1e-24

QUERY 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactca 104

                                                  aatttaggaaactca 15

     tccttcagaagtaaagcactatacatttttttgtttgttcttttcaatttaggaaactca 61

                                                                     \

                                                                     |

                                                                     a

……

-m 3:显示query在所有subjects的定位和一致性比对信息,不显示subjects之间的差异。

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

subject2                                                             119   2e-32

subject1                                                              94   1e-24

QUERY 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactc- 103

                                                  ..............- 14

     .........................ttttttt...........................a 60

……

-m 4:显示query在所有subjects上的定位信息但是不显示一致性比对信息,不显示subjects之间的差异。

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

subject2                                                             119   2e-32

subject1                                                              94   1e-24

QUERY 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactc- 103

                                                  aatttaggaaactc- 14

     tccttcagaagtaaagcactatacatttttttgtttgttcttttcaatttaggaaactca 60

……

-m 5:显示query在所有subjects上的定位信息但是不显示每个碱基的比对信息,补充"-"对齐比对区域,subjects之间不同的碱基会被标出。

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

subject2                                                             119   2e-32

subject1                                                              94   1e-24

 

QUERY 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactca 104

     ---------------------------------------------aatttaggaaactca 15

     tccttcagaagtaaagcactatacatttttttgtttgttcttttcaatttaggaaactca 61

                                                                     \

                                                                     |

                                                                     a

……

-m 6:显示query在所有subjects上的定位信息但是不显示每个碱基的比对信息,补充"-"对齐比对区域,不显示subjects之间的差异。

Sequences producing significant alignments:                        (bits) Value

subject2                                                             119   2e-32

subject1                                                              94   1e-24

QUERY 45  tccttcagaagtaaagcactatacannnnnnngtttgttcttttcaatttaggaaactc- 103

     ---------------------------------------------aatttaggaaactc- 14

     tccttcagaagtaaagcactatacatttttttgtttgttcttttcaatttaggaaactca 60

……

-m 7:输出XML格式的blast结果。

        <Hsp_num>1</Hsp_num>

        <Hsp_bit-score>119.434</Hsp_bit-score>

        <Hsp_score>60</Hsp_score>

        <Hsp_ue>1.95644e-32</Hsp_ue>

        <Hsp_query-from>90</Hsp_query-from>

        <Hsp_query-to>149</Hsp_query-to>

        <Hsp_hit-from>1</Hsp_hit-from>

        <Hsp_hit-to>60</Hsp_hit-to>

        <Hsp_query-frame>1</Hsp_query-frame>

        <Hsp_hit-frame>1</Hsp_hit-frame>

        <Hsp_identity>60</Hsp_identity>

        <Hsp_positive>60</Hsp_positive>

        <Hsp_align-len>60</Hsp_align-len>

        <Hsp_qseq>AATTTAGGAAACTCAATGAACAATGAATACGAACTATTATTA</Hsp_qseq>

        <Hsp_hseq>AATTTAGGAAACTCAATGAACAATGAATACGAACTATTATTA</Hsp_hseq>

        <Hsp_midline>||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||</Hsp_midline>

……

-m 8:列表格式的比对结果。从左到右各列的意义依次是:query名、subject名、identity、比对长度、错配数、空位数、query比对起始坐标、query比对终止坐标、subject比对起始坐标、subject比对终止坐标、期望值、比对得分。

query1 sub24   91.11   45       198   241   502208  502252  2.7e-06 50.05

query1 sub21   98.68   151      532   682   1360665 1360515 1.0e-76 284.0

query1 sub21   86.17   94    12    198   290   479232  479139  4.8e-14 75.82

query1 sub21   87.04   54       238   291   1297867 1297920 6.9e-07 52.03

query2 sub21   99.44   892      28    918   1351055 1350165 0.0     1713.2

query2 sub21   87.58   153   17    343   495   1358110 1357960 2.1e-35 147.2

query2 sub21   84.11   107   16    699   805   1305723 1305618 4.0e-12 69.88

query2 sub21   89.58   48       519   566   1305968 1305921 6.0e-08 56.00

query2 sub14   88.24   153   16    343   495   145402  145252  8.7e-38 155.1

query2 sub24   88.08   151   16    345   495   567561  567709  1.4e-36 151.2

query2 sub24   87.80   123   14    686   808   563341  563220  1.9e-26 117.5

 

在m8格式中通过subject的比对起止位置可以判断出序列的比对方向。比如上述结果中第1行,subject的起始坐标小于终止坐标,则两条序列是同方向比对上的;第2行中subject起始坐标大于终止坐标,则query序列是和subject的互补链比上的。

-m 9:带注释行的列表格式。格式和-m 8一样,只是在每个query的比对结果前面加了注释行用以说明列表中各列的意义。

# BLASTN 2.2.8 [Jan-05-2004]

# Query: query1   out.ace.1

# Database: database.seq

# Fields: Query id, Subject id, % identity, alignment length, mismatches, gap openings, q. start, q. end, s. start, s. end, e-value, bit score

query1 sub24   91.11   45       198   241   502208  502252  2.7e-06 50.05

query1 sub21   98.68   151    0    532   682   1360665 1360515 1.0e-76 284.0

query1 sub21   86.17   94    12    198   290   479232  479139  4.8e-14 75.82

query1 sub21   87.04   54       238   291   1297867 1297920 6.9e-07 52.03

# BLASTN 2.2.8 [Jan-05-2004]

# Query: query1   out.ace.1

# Database: database.seq

# Fields: Query id, Subject id, % identity, alignment length, mismatches, gap openings, q. start, q. end, s. start, s. end, e-value, bit score

query2 sub21   99.44   892      28    918   1351055 1350165 0.0     1713.2

query2 sub21   87.58   153   17    343   495   1358110 1357960 2.1e-35 147.2

query2 sub21   84.11   107   16    699   805   1305723 1305618 4.0e-12 69.88

query2 sub21   89.58   48       519   566   1305968 1305921 6.0e-08 56.00

query2 sub14   88.24   153   16    343   495   145402  145252  8.7e-38 155.1

query2 sub24   88.08   151   16    345   495   567561  567709  1.4e-36 151.2

query2 sub24   87.80   123   14    686   808   563341  563220  1.9e-26 117.5

-m 10和11:分别是ASN格式的文本文件和二进制文件,这里就不做介绍了。

“-m”参数的值从1到6都是为了便于在subjects之间做比较而设立的功能;8和9保留了所有比对结果的原貌,只是统计成了列表的格式,从而大幅度降低了存储空间的消耗,并使结果更加清晰易读。但是m8/m9格式也有相应的缺点,就是损失了一部分比对信息,除了序列长度信息和比对条形图以外,还会在blastx、tblastn和tblastx的比对中损失关键的相位信息,这是要尽量避免的。因此在大规模的blastn比对任务中,往往要采用m8格式的输出结果来节省空间;而在小规模高精度比对中,通常用默认的输出格式,再用其他程序来提取结果中的有用信息。

4.-v参数和-b参数:

这两个参数都是限制输出结果的数量的。

-v (integer):规定输出中每一个query的比对列表最多显示subject个数(即"Sequences producing significant alignments:"后面列出的subjects数目),缺省为500条。

-b (integer):规定输出中每个query最多显示与多少条subject的比对条形图(即每条query的结果中">"的个数),缺省为250条。

如果同时使用"-m 8"参数,则输出结果中的subjects数量和"-b"参数规定的数量一致。

在database数据中能和query比上的subjects过多的时候,这两个参数就能够帮助我们把其中比对结果最好的一部分挑出来,屏蔽掉相对差的结果。当然有些时候我们是不希望屏蔽掉这些结果的,比如在某个大基因组的Contig数据集中统计一条转座子的重复次数,就需要把"-v"和"-b"参数定的足够大以显示所有结果。

5.-T参数:

-T (T/F)参数用于决定是否输出html格式的比对结果,缺省值为"F"。选择"-T T"就会输出html格式的比对结果。如果在建库过程中选择了"-o T",并且database数据中的序列是以gi号命名的,那么在html结果中以gi号命名的相应序列会自动链接到NCBI的数据库上。如图3-14:

 

图3-16 html格式的blast结果

6.-M参数:

做有关蛋白的比对时,需要用"-M"参数指定取代矩阵,比如BLOSUM45、BLOSUM62、BLOSUM80等,缺省值为BLOSUM62。这三个矩阵都可以在blast安装目录的data目录下找到。BLOSUM矩阵后面的数字代表比对结果允许的最低相似度百分比,我们可以根据不同的精度需求选择不同的取代矩阵。BLOSUM62的内容如下:

Matrix made by matblas from blosum62.iij

* column uses minimum score

BLOSUM Clustered Scoring Matrix in 1/2 Bit Units

Blocks Database = /data/blocks_5.0/blocks.dat

Cluster Percentage: >= 62

Entropy =   0.6979, Expected =  -0.5209

   *

4 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  0 -3 -2  0 -2 -1  0 -4

R -1  0 -2 -3  0 -2  0 -3 -2  2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1  0 -1 -4

N -2  1 -3  1 -3 -3  0 -2 -3 -2  0 -4 -2 -3  0 -1 -4

D -2 -2  6 -3  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3  1 -1 -4

0 -3 -3 -3  9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -2 -4

Q -1  0 -3  2 -2  0 -3 -2  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2  3 -1 -4

E -1  2 -4  5 -2  0 -3 -3  1 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2  4 -1 -4

0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -1 -4

H -2  1 -1 -3  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2  2 -3   0 -1 -4

I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  2 -3  0 -3 -2 -1 -3 -1  3 -3 -3 -1 -4

L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  4 -2  0 -3 -2 -1 -2 -1  1 -4 -3 -1 -4

K -1  0 -1 -3  1 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2  1 -1 -4

M -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  2 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1  1 -3 -1 -1 -4

F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0 -3  6 -4 -2 -2  3 -1 -3 -3 -1 -4

P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -2 -4

1 -1  0 -1  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  1 -3 -2 -2  0 -4

0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  5 -2 -2  0 -1 -1  0 -4

W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11  2 -3 -4 -3 -2 -4

Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  7 -1 -3 -2 -1 -4

0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4 -3 -2 -1 -4

B -2 -1  4 -3  1 -1  0 -3 -4  0 -3 -3 -2  0 -1 -4 -3 -3  1 -1 -4

Z -1  1 -3  4 -2  0 -3 -3  1 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2  4 -1 -4

0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -2  0 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -4

* -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4  1

 

7.-W参数:

-W(integer):指定做比对时的“字”的长度。缺省值是0(代表blastn的搜索字长为11,megablast是28,其他是3)。这个参数多数时候不用调整,但是需要做短序列的比对时,可能要适当调短字长,来增加比对的敏感度。

以上为blastall 的常用参数,对于一些不常用的参数,可以查找blast的参数表,此参数表可以通过直接运行blastall得到。

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