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云之南

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专业背景:计算机科学 研究方向与兴趣: JavaEE-Web软件开发, 生物信息学, 数据挖掘与机器学习, 智能信息系统 目前工作: 基因组, 转录组, NGS高通量数据分析, 生物数据挖掘, 植物系统发育和比较进化基因组学

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RACE技术  

2009-12-29 13:24:31|  分类: 生物信息学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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RACE技术

 

RACE技术-参考资料

      [1]  中国生命科学论坛  http://bbs.bioon.com/bbs/viewthread.php?tid=264673

[2]  中国论文下载中心 http://www.studa.net/yaoxue/081104/09425827.html

[3]  鸭绿江学术资源论坛 http://forum.e2002.com/viewthread.php?tid=111090

RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE的扩增原理图

RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,通过PCR技术实现的,无须建立cDNA文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段,通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。

目录 [隐藏]

RACE技术-主要分类

     

一般分5-和3-RACE两种。

3-RACE较简单,首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录,根据一般基因具有polyA尾巴的特点,选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。

5-RACE相对较难,目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统),根据接头引物和自己设计特异引物PCR,可以设计巢式PCR二次扩增。另外,有利用反向PCR技术,连接成环在PCR。还有,GENE公司一种smartRACEPCR,利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头,转换模板而无需用连接酶加接头。

RACE技术-发展历史

     

RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术

经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995:Chen,1998:Bespalova等,1998:Matz等1999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA,从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善,目前己有商业化RACE技术产品推出,如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应,结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为,进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。

RACE技术-引物设计

     

基因特异性引物(GSPs)应该是:

1、23-28nt

2、50-70%GC

3、Tm值≥65度,Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在,PCR的产物是特异性的。

4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很高。

5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度

6、在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

8、引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和形成分子内氢键。另外,避免使用与AP1互补的引物,尤其是在3‘末端。

9、如果要用重叠片段来检测设计的引物,GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中,退火温度高于AP1引物的Tm值,可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度,可以进行随后的PCR循环。

11、验证基因特异性引物的对照:

单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。

利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达,利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段,应该重复cDNA的合成,或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。

12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后,利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。

RACE技术-比较与优化

     

RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术

目的:研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点,并对它们进行了优化。

方法:以播娘蒿RNA为模板,先按文献标准方法进行5'RACE,然后通过增加反应时间,提高部分反应物浓度等方法进行优化。

结果:未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见,SMART反转录酶法隐约可见条带,但不清晰。优化条件后,环化法出现弥散条带,TdT酶法胜之,但条带依旧弥散,而SMART反转录酶法最佳,获得清晰特异性条带。结论SMART5'RACE效果最好,其次为TdT酶法,环化法效果有待改进,同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性,为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据

RACE技术-实验步骤

     

cDNA第一条链的合成:

我们建议进行cDNA合成的对照反应,这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中42度保温一个小时。

注意:在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积,从而降低第一链的合成效率。将管放于上,以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。

cDNA第二链的合成:

第二链合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照,试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。

1、建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5-3kb之间。

2、通过电泳检测cDNA的产量,与对照进行对比,这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。

3、按照程序进行连接反应。

4、如果没有对比样品和对照的产量,利用Tricine-EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物,用两种稀释物进行RACEPCR反应,直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。

RACE技术-PCR扩增

     

RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南PCR扩增

进行5’和3’的RACE-PCR扩增。

利用以下的程序进行降落PCR反应:

94度30秒

5个循环

(1)94度5秒

(2)72度4分

5个循环:

(1)94度5秒

(2)70度4分钟

20-25个循环:

(1)94度5

(2)68度4分钟

注意:

我们建议使用降落PCR反应,这就要求GSP的Tm值≥70度。

1、当循环结束时,利用1.2%琼脂凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl,使用适当的分子量marker。

2、可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2-5kb的时候,经常使用4min,0.2-2kb的时候将延伸时间减到2-3min,对于5-10kb的条带,延伸时间增加到10min。

RACE技术-产物验证

     

1、应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。

2、有3种验证RACE产物的方法:

(1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。

(2)Southernblot

(3)克隆并测序

3、建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由GSP和NGSP获得RACE产物。

4、对于5‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。

5、对于3‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。

6、如果条带是正确的,在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。

RACE技术-克隆和测序

     

1、可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物,此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。2、电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。

3、将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点,将产物克隆到常规载体中。

4、对于5‘端的RACE产物,我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端,尤其是长模板。另外,T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0-20个碱基。)

5、一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。

RACE技术-cDNA的获得

     

RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE技术 - fhqdddddd - 流浪云南RACE的扩增原理图

通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR和克隆的方法。

通过PCR的方法获得全长cDNA:

1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。

2、根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23-28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。

3、进行如下的热循环:

94度30秒

25个循环:

(1)94度5秒

(2)72度2-15分钟

4、延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带,用6+2=8分钟的延伸时间。注意:如果没有条带或者条带弱,增加5个循环;或者优化PCR的条件。

5、在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA。

6、制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA。

7、将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker。

8、利用长波紫外观察cDNA(≧300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。

9、利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。

10、将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。

通过克隆产生全长的cDNA:

1、如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物,同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话,通过克隆技术可以获得全长的cDNA。

2、利用酶切获得的3‘和5’扩增产物,并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。

3、在哺乳动物基因组中,NOT1和Srf1酶切非常稀少,大约106bp才出现一次,因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。

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