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云之南

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关于我

专业背景:计算机科学 研究方向与兴趣: JavaEE-Web软件开发, 生物信息学, 数据挖掘与机器学习, 智能信息系统 目前工作: 基因组, 转录组, NGS高通量数据分析, 生物数据挖掘, 植物系统发育和比较进化基因组学

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计算Ratio 值(= Cy3/Cy5)  

2009-11-24 16:28:36|  分类: 生物学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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http://www.bio168.com/mag/24B2D811E3CF/12635820FA51.html
 
计算Ratio 值(= Cy3/Cy5)。在0.5-2.0 之
外的定义为在两样本中有明显差异表达。
进而获取初步功能信息。

DNA标记效率的快速检测

利用荧光染料 Cy3、Cy5检测cDNA样品的标记效率

前言

目前,在基因研究、疾病诊断以及毒物学研究等领域中微阵列技术被用于研究不同组织来源或经过不同处理的细胞间的基因表达差异( 1 , 2 , 3 , 4 )。科学研究者可以购买或者自己制作用于微阵列实验的芯片。芯片的制作就是在合适的载体表面点上大量感兴趣的基因(通常以玻片为载体)。然后提取组织当中的 RNA ,反转录成 cDNA 。在反转录的过程中荧光标记的 dUTP 被整合到新合成的 cDNA 产物中。在目标基因和探针杂交之前,检测 cDNA 样品的标记效率是非常重要的。

在这篇应用文章中我们介绍了利用 TECAN GENios Plus 多功能酶标仪对荧光染料 Cy5 的分光光度值进行测定的方法。 Cy3 和 Cy5 的光吸收用 TECAN SAFIRE 光栅酶标仪检测。用 260nm 光吸收对核酸定量, Cy3 和 Cy5 的浓度用分光光度法分析它们各自的最大吸收峰。 cDNA 产物中每种荧光染料的量可以从这些数据计算得出。

材料和方法

DNA 标记

?  取 2μg polyA RNA ( 15-80μg 全基因组 RNA )

?  取 2μl Oligo dT 引物( 1μg/μl )

?  加入 15μl DEPC H 2 O

?  70 ℃ 孵育 10 分钟,冰上冷却。

?  加入 6μl 5× 第一链缓冲液

3μl 0.1M DTT

0.6μl dNTP-Mix(APB) ,内含

25 μ l dATP(100mM)

25 μ l dCTP(100mM)

25μl dGTP(100mM)

15 μ l dTTP(100mM)

10 μ l 10mM Tris , pH7.5

3μl Cy5 或 Cy3 dUTP(1mM, APB)

2μl Superscript II(200U/μl, Gibco BRL)

?  加入 30μl DEPC H 2 O

?  42 ℃ 孵育 1.5-2 小时

?  加入 1.5μl 20mM EDTA 终止反应

?  加入 1.5μl 0.1N NaOH , 70 ℃ 孵育 10 分钟, RNA 降解

?  加入 1.5μl 0.1N HCL 中和

?  GFX 柱纯化, 50μl 10mM TE , pH8.0 ,洗两次

?  加入 20μg Cot1 DNA , Speed Vac 冷冻干燥

?  20μl DEPC H 2 O 溶解 DNA

仪器

?  Tecan GENios Plus 多功能酶标仪, 260nm 、 550nm 、 650nm 滤光片

?  SAFIRE 光栅酶标仪

实验结果

Cy3 和 Cy5 标记的 cDNA 样品的吸收光谱

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

图 1. 分别标记 Cy3 和 Cy5 的 cDNA 样品的吸收光谱

TECAN SAFIRE 光栅荧光扫描仪可以显示出 Cy3 在 550nm 的典型吸收峰以及 Cy5 在 650nm 的典型吸收峰。

标记 cDNA 样品的光吸收检测

Cy3 、 Cy5 标记 cDNA 样品以及空白孔的光吸收值。测量在 384 孔板上进行( Costar , UV 板,平底, Corning no.3675 ,加样体积: 50μl )。

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

全部 cDNA 得率计算

由于缺少稳定的 cDNA 标准物,样品的全部 cDNA 得率可以通过方程 1 计算得出。方程 1 基于 A260 为 1.0 时(光程为 1cm ) cDNA 含量为 33μg/ml 推导得出。

方程 1 :

total cDNA(μg) = A260/b × 33(μg/ml) × vcDNA

A260 260nm 光吸收值

b 光程( cm )

vcDNA 体积( ml )

全部 cDNA 的得率通过方程 1 得出:

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

荧光染料浓度测定

荧光染料浓度可以通过做合适的标准曲线得出,或通过方程 2 计算得出( Beer-Lambert 法则)。

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

图 2. Cy3 梯度稀释

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

图 3. Cy5 梯度稀释

方程 2 :

光吸收值= ε*c*b

ε 摩尔消光系数

c 分析物浓度

b 光程( cm )

Cy3 、 Cy5 的摩尔浓度计算公式:

方程 3 :

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

cF 荧光染料浓度

εCy3 Cy3 的摩尔消光系数( 150000/M/cm )

εCy5 Cy5 的摩尔消光系数( 250000/M/cm )

b 光程( cm )

Cy3 、 Cy5 的摩尔浓度通过方程 3 计算得出:

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

cDNA 样品中荧光值比例计算

通过 Cy3 、 Cy5 的分子量( Cy3 0.0576μg/μM 、 Cy5 0.0589μg/μM )可以计算出每 μg cDNA 中所含荧光染料量( μg )(%掺入率):

方程 4 :

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

cF 荧光染料浓度( μM )

MW 荧光染料分子量( μg/μM )

荧光染料的掺入率通过方程 4 计算得出:

计算Ratio 值(= Cy3/Cy5) - fhqdddddd - 流浪云南

结论

在这篇文章中我们演示了如何利用 Tecan Genios Plus 酶标仪计算 Cy3 和 Cy5 荧光染料标记 cDNA 样品的标记效率。

参考文献

(1) BOWTELL, D.D. (1999): Options available--from start to finish--for obtaining expression data by microarray. Nat Genet. 1999 Jan; 21(1 Suppl) :25-32. Review.

(2) BROWN, P.O. and BOTSTEIN, D (1999). Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nat Genet. 1999 Jan; 21(1 Suppl) :33-7. Review.

(3) DUGGAN, D.J., BITTNER M., CHEN, Y., MELTZER, P. , and TRENT, J.M. (1999): Expression profiling using cDNA microarrays. Nat Genet. 1999 Jan;21 (1 Suppl) :10-4. Review.

(4) SOUTHERN, E., MIR, K. , and SCHEPINOV, M. (1999): Molecular interactions on microar rays. Nat Genet. 1999 Jan; 21(1 Suppl) :5-9. Review.

 

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